Diagnóstico de enfermedades genéticas por secuenciación automática: cáncer gástrico (página 2)

Para la amplificación por
PCR los primers utilizados fueron:
CDH1_12f: gggACACTTCTgCTgATCC

CDH1_12r:
ATgCTACAAAgTTAgATACCA

Los cic realizados fueron:
Desnaturalización inicial: 3min a 95ºC
Melting 45seg a 94ºC
Annealing 45seg a 56ºC
Elongación 45seg a 72ºC
Elongación final por 10 min a 72ºC

Se realizaron un total de 30 ciclos de PCR (Meeting,
Annealing y elongación). Las muestras obtenidas luego de
la reacción de PCR fueron resueltas en un gel de agarosa
1,4% con el marcador de peso pUC19.

Luego de la corrida electroforética, se
degradaron el exceso de primers y de dNTP`s del producto de
PCR, ya que estos pueden interferir con el buen funcionamiento
y con la resolución de la reacción de
secuenciación. Esta degradación se realizó
utilizando la enzima comercial ExoSAP-IT. El protocolo de
degradación utilizado fue el siguiente:

Se colocaron 3uL de producto de PCR, 1uL de ExoSAP-IT
y 3uL de agua en un
tubo de PCR y se incubaron durante 30` a 37 grados C y luego se
inactivó la enzima por medio de la incubación a
80 grados C durante 15`.

La reacción de secuenciación se llevo a
cabo utilizando los mismos primers de la PCR.

Resultados

Los productos de
PCR luego de la corrida electroforética se observaron en
el gel de agarosa de la siguiente manera.

Figura 1. Resolución de los
productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa
1,4%.

En este gel se puede observar que ambas fuentes de
ADN (individuos
A y B) presentan el gen codificante para la proteína
CDH1 dentro de su secuencia genómica. En todos los casos
las bandas presentes son del mismo peso molecular, y tal como
es esperable, no se observa banda alguna en los controles
negativos realizados. Asimismo en todos los casos la intensidad
de la banda del ADN proveniente del individuo A
es de menor intensidad que la banda proveniente del individuo
B. Esta diferencia de intensidad probablemente se debe a que la
concentración inicial de ADN en ambas muestras no fue la
misma, encontrándose una mayor concentración en
la muestra del
individuo B que en el individuo A. Esto no puede aseverarse ya
que no se ha utilizado un control de
carga.

Secuenciación:

Durante el desarrollo
de este trabajo
práctico no se llevo a cabo la secuenciación del
producto de PCR, así que se estudiarán los
resultados obtenidos a partir de una secuenciación
previa, considerando que los mismos son los resultados de este
trabajo.

En la Figura 2 se observa el cromatograma obtenido a
partir de la secuenciación con el primer forward.
Se puede observar la sustitución de una guanina por una
adenina en la posición 152 de la secuenciación
(la cual no es la misma que la posición en el gen). En
el cromatograma, esto se observa como dos picos superpuestos,
luego de consultar la base de
datos de genes GenBank se puedo conocer que la secuencia
salvaje del gen que codifica para CDH1 contiene en dicha
posición el nucleótido complementario a una
adenina. Luego que en el cromatograma se observan los dos picos
superpuestos, se puede decir que en uno de los dos alelos que
codifican para dicho gen, el individuo analizado, posee una
adenina mientras que en el otro alelo posee una
guanina.

Figura 2. Cromatograma obtenido a
partir de la secuenciación con el primer forward de un
organismo mutante heterocigota.

En la Figura 3 se observa el cromatograma obtenido a
partir de la secuenciación con el primer reverse.
En este se puede observar la mutación complementaria a la
observada con el primer forward (Figura 2); es decir se puede
observar la sustitución de una citosina por una timina en
la posición 198 de la secuenciación. En el
cromatograma, esto se observa nuevamente como dos picos
superpuestos.

Figura 3. Cromatograma obtenido a
partir de la secuenciación con el primer reverse de un
organismo mutante heterocigota.

Se puede observar que en los dos picos superpuestos de
la figura 2, el programa que
analiza el cromatograma, asigno en esta posición una G
(guanina), debido a que el pico de guanina tiene una intensidad
levemente mayor. Mientras que en la figura 3, ante un caso
similar, aunque ambos picos tienen la misma intensidad, el
programa no determinó un nucleótido
específico, asignando la letra N
(not-specified). Esto indica que no solo debe
estudiarse la secuencia que el programa automáticamente
nos proporciona, sino que además debe estudiarse el
cromatograma presentado para la secuencia que estamos
analizando.

Análisis de las secuencias:

Se buscó la secuencia salvaje del gen que
codifica para la proteína CDH1, y se copió la
secuencia en la cual se encuentra la mutación que
está relacionada con el
cáncer gástrico. La misma está dentro
del exón 12. A continuación se presenta la
secuencia salvaje que contiene el fragmento secuenciado en el
desarrollo de este trabajo práctico. De esta manera
esperamos encontrar el nucleótido que se encuentra en el
genotipo salvaje, el cual al ser sustituido en ambos alelos,
provoca cáncer gástrico. En la secuencia que se
encuentra a continuación se destacó el
nucleótido mutado en el individuo analizado previamente
por secuenciación. Se puede observar que se produce una
sustitución puntual de una guanina por una
adenina.

86041 agaactaggg aaacaacagg caggcaatag gacttcttgg
agtagttaaa attcagtgaa

86101 tgaataacga tatgtgaaga aggaggagtg tgttcttggt
gtgaggaata acttgaataa

86161 ttgttatcaa ggtgggaata agttgtctgt gtaaaacggc
cagagacctg cccacctggg

86221 agtggaggtc ctttgggatt ggtgggacag gaggttctgc
gggtggagtg gggcctggtg

86281 agggaccact gaagagccag gacaagatct agacttggtc
tggtggaagg caatggggat

86341 tcattactgt tgccaagctg ccacattttc tgtgtatttt
ctcttaggtt ctccagttgc

86401 tactggaaca gggacacttc tgctgatcct gtctgatgtg
aatgacaacg cccccatacc

86461 agaacctcga actatattct tctgtgagag gaatccaaag
cctcaggtca taaacatcat

86521 tgatgcagac cttcctccca atacatctcc cttcacagca
gaactaacac acggggcgag

86581 tgccaactgg accattcagt acaacgaccc aagtgggtac
ctgagtttta ttttggcaac

86641 tttgctccaa ctgccatgct tcccttcccc cagatcccca
cctttcaatt tcccttctca

86701 acttctagat gtcacccctt ccattgatac ttgcttcctt
gtcccttctg tctttgaggc

86761 cttgctccaa aggtcttttt cctttcctgg tatctaactt
tgtagcatgc tacccagtaa

86821 tctaaaaccc aagcagggct ccctctccca gcctctagcc
accctccact cccctctcca

86881 cttgcaacca ggaccatctt ctctgctacc tcctgctcct
gggaccaaac aacaccattt

86941 ttgtggttag ctccttcttg ccaaccaatc gtgagctccc
agattcatca gaactattct

87001 accgaggtgg aggcagctgt caactgcctg gtcaatttgc
atatatgggc ttcctacacc

87061 tacttctctc tgggcttcta tttccaccat gacgatgtgg
atctggaagg tgtgcaccac

87121 ttcttccaca aattggccaa ggagaagcac aagggcgctg
agtgtccctt gaaaatgcaa

87181 aaccagtgtg gcggccgcac tgtcttcccg gacatccaga
agccatgtaa agatgaatgg

87241 ggtaaaaccc tgggtgcgat ggaagtcact ctggccctgg
agaagaacct gaactggacc

87301 cttttggatc ttcatgcctt gggttccacc tgcacagacc
cccatatctg tgacttcctg

87361 gagagccact tcctagatga aaaagtaaaa ctcatcaaga
agataggtga ccacctgacc

87421 aaccttcaca ggccagccgg cctccaggcc gggctgggca
aaaaggttca ccctcaggca

87481 cacgggagcc taccgaaccc agcgacatct gaagagcccc
gctctgccta agcctctccc

87541 tccagccact aggcagcttt tttaaaccaa ctctagagcc
ctctcccaag ccttagacca

87601 aatggaaata aagcttttta cagcaaaaaa aaaaaaaaaa
aagtacatac ctaaataaaa

87661 cccaagcagc tctgctctct tcactcggct tgcgggtgtc
tttagttcac tagcaatttt

87721 attctggaat gagcttttta ttttcctccc ctggtctcat
catttctttt tattgctttc

87781 tccagcccaa gaatctatca ttttgaagcc aaagatggcc
ttagaggtgg gtgactacaa

87841 aatcaatctc aagctcatgg ataaccagaa taaagaccaa
gtgaccacct tagaggtcag

87901 cgtgtgtgac tgtgaagggg ccgccggcgt ctgtaggaag
gcacagcctg tcgaagcagg

87961 attgcaaatt cctgccattc tggggattct tggaggaatt
cttgctttgc taagtaagtc

88021 cagctggcaa agtgactcag cctttgactt aaaaaaatgg
aggaggttta tttcctggaa

88081 atgatttttg ttcttatatt aataaggata taggttagct
gatgtgggaa agagactccc

Secuencia 1. Secuencia de nucleótidos
parcial del gen CDH1 salvaje.

Se realizó un blast2seq para encontrar donde
esta la región de homología entre la secuencia
analizada y la secuencia del gen. Se encontró que el
fragmento secuenciado es homologo a una región del gen
que se encuentra en la región que se muestra a
continuación:

Score = 637 bits (331), Expect = 2e-179

Identities = 331/331 (100%), Gaps = 0/331
(0%)

Strand=Plus/Plus

Query 27
CCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGAT
86

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86465
CCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGAT
86524

Query 87
GCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCC
146

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86525
GCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCC
86584

Query 147 AACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAAGTGGGTACCTGAGTTTTATTTTGGCAACTTTG
206

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86585
AACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAAGTGGGTACCTGAGTTTTATTTTGGCAACTTTG
86644

Query 207
CTCCAACTGCCATGCTTCCCTTCCCCCAGATCCCCACCTTTCAATTTCCCTTCTCAACTT
266

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86645
CTCCAACTGCCATGCTTCCCTTCCCCCAGATCCCCACCTTTCAATTTCCCTTCTCAACTT
86704

Query 267
CTAGATGTCACCCCTTCCATTGATACTTGCTTCCTTGTCCCTTCTGTCTTTGAGGCCTTG
326

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86705
CTAGATGTCACCCCTTCCATTGATACTTGCTTCCTTGTCCCTTCTGTCTTTGAGGCCTTG
86764

Query 327 CTCCAAAGGTCTTTTTCCTTTCCTGGTATCT 357

|||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 86765 CTCCAAAGGTCTTTTTCCTTTCCTGGTATCT
86795

Se buscó en el NCBI la secuencia salvaje de la
E-cadherina epitelial humana CDH1, y se copió la
secuencia en la cual se encuentra la sustitución de un
aminoácido que está relacionada con el
cáncer gástrico. La misma se presenta a
continuación. Se puede observar que la
sustitución puntual del nucleótido observada la
cual se traduce como la sustitución de un triptofano por
un codón de stop en la posición 638 de la
proteína. Esta mutación se denomina
mutación sin sentido. 

1 mgpwsrslsa lllllqvssw lcqepepchp gfdaesytft vprrhlergr
vlgrvnfedc

61 tgrqrtayfs ldtrfkvgtd gvitvkrplr fhnpqihflv
yawdstyrkf stkvtlntvg

121 hhhrppphqa svsgiqaell tfpnsspglr rqkrdwvipp
iscpenekgp fpknlvqiks

181 nkdkegkvfy sitgqgadtp pvgvfiiere tgwlkvtepl
dreriatytl fshavssngn

241 avedpmeili tvtdqndnkp eftqevfkgs vmegalpgts
vmevtatdad ddvntynaai

301 aytilsqdpe lpdknmftin rntgvisvvt tgldresfpt
ytlvvqaadl qgeglsttat

361 avitvtdtnd nppifnptty kgqvpenean vvittlkvtd
adapntpawe avytilnddg

421 gqfvvttnpv nndgilktak gldfeakqqy ilhvavtnvv
pfevslttst atvtvdvldv

481 neapifvppe krvevsedfg vgqeitsyta qepdtfmeqk
ityriwrdta nwleinpdtg

541 aistraeldr edfehvknst ytaliiatdn gspvatgtgt
lllilsdvnd napipeprti

601 ffcernpkpq viniidadlp pntspftael
thgasanwti
qyndptqesi ilkpkmalev

661 gdykinlklm dnqnkdqvtt levsvcdceg aagvcrkaqp
veaglqipai lgilggilal

721 lililllllf lrrravvkep llppeddtrd nvyyydeegg
geedqdfdls qlhrgldarp

781 evtrndvapt lmsvprylpr panpdeignf idenlkaadt
dptappydsl lvfdyegsgs

841 eaaslsslns sesdkdqdyd ylnewgnrfk kladmyggge
dd

Secuencia 2. Secuencia de aminoácidos de
la proteína CDH1 salvaje.

Conclusiones:

A partir de los resultados obtenidos en la
secuenciación del individuo heterocigota, y combinando
dichos resultados con las bases de datos del NCBI,
se pudo determinar cual es la mutación puntual que tiene
como consecuencia el desarrollo del mencionado tipo de
cáncer gástrico. Para lograr este resultado,
debimos hacer uso de el soft para análisis de cromatogramas FinchTV, las
bases de datos
del NCBI (GenBank y Protein), así como también
del sistema de
búsqueda de secuencias Blast. Estos programas son
algunas de las principales herramientas
bioinformáticas de amplio uso tanto en biotecnología como en biología
molecular.

Por otro lado el análisis de los cromatogramas
y las secuencias predictivas del FinchTV permitió
comprender la importancia del análisis del cromatograma
y de la secuencia, ya que errores en el análisis
automático de la secuencia pueden acarrear errores
posteriores.

Fabián A. Shalóm

Ayelen Rapoport

Cátedra de Genética
Humana – Instituto de Inv. Biotecnológicas –
Univ. Nac. de San Martín

Av. General Paz 5445, INTI, Edificio 24 , Prov. de Bs.
As.

Octubre de 2007